Los científicos rastrean los procesos a nanoescala de los complejos CRISPR-Cas

Cuando las bacterias son atacadas por un virus, pueden defenderse con un mecanismo que repele el material genético introducido por el intruso. La clave son los complejos proteicos CRISPR-Cas. Su función en la inmunidad adaptativa en microorganismos fue descubierta y dilucidada recién en la última década. Con la ayuda del ARN integrado, los complejos CRISPR reconocen una secuencia corta en el ADN del atacante. Desde entonces, la maquinaria de reconocimiento de secuencias por ARN se ha utilizado para desactivar y modificar genes de forma selectiva en cualquier organismo. Este descubrimiento revolucionó la ingeniería genética y ya ha sido galardonado en 2020 con el Premio Nobel de Química otorgado a Emmanuelle Charpentier y Jennifer A. Dodna.

Sin embargo, los complejos CRISPR a veces también interactúan con segmentos de genes que difieren ligeramente de la secuencia especificada por el ARN. Esto conduce a efectos secundarios no deseados en aplicaciones médicas. «Las razones de esto aún no se comprenden bien, ya que el proceso aún no se puede observar directamente», dice Dominique Cauert, quien trabajó en el proyecto como estudiante de doctorado.

Seguimiento de procesos a nanoescala en detalle

Para comprender mejor el proceso de reconocimiento, el equipo dirigido por los profesores Ralph Seidel y Dominique Cauert aprovechó el hecho de que la doble hélice del ADN de la secuencia objetivo se desenrolla durante el reconocimiento para permitir el emparejamiento de bases con el ARN. “La pregunta principal del proyecto era si el desenrollado de una pieza de ADN de solo 10 nanómetros de largo se puede rastrear en tiempo real”, dice Kawert.

Para observar el proceso de la mandíbula en detalle, los científicos tuvieron que hacerlo visible bajo un microscopio. Para lograr este objetivo, el equipo se basó en los logros de la nanotecnología del ADN, que se puede utilizar para crear cualquier nanoestructura de ADN en 3D. Usando lo que se llama una técnica de origami de ADN, los investigadores han construido un brazo giratorio de 75 nanómetros de largo con nanopartículas de oro adheridas a su extremo. En el experimento, se movió una secuencia de ADN de 2 nm de largo por 10 nm de grosor para rotar nanopartículas de oro a lo largo de un círculo de 160 nm de diámetro; este movimiento se puede ampliar y rastrear usando una configuración de microscopio especial.

Usando este nuevo método, los investigadores pudieron observar el reconocimiento de secuencias por parte del complejo CRISPR Cascade casi par de bases por par de bases. Sorprendentemente, el apareamiento de bases con el ARN no es energéticamente informativo, lo que significa que el complejo se une de manera inestable solo durante el reconocimiento de la secuencia. Solo cuando se reconoce la secuencia completa se produce una unión estable y el ADN se destruye posteriormente. Si esta es la secuencia de destino «incorrecta», se cancela la operación.

Los resultados ayudarán a elegir la secuencia de ARN adecuada

El hecho de que el proceso de reconocimiento produzca en ocasiones resultados incorrectos se debe a su naturaleza estocástica, es decir, a movimientos moleculares aleatorios, como ahora han podido demostrar los investigadores. «El reconocimiento de secuencias está impulsado por las fluctuaciones térmicas en el emparejamiento de bases», dice Kawert. Usando los datos obtenidos, fue posible construir un modelo termodinámico de reconocimiento de secuencias que describe el reconocimiento de segmentos de secuencias sesgadas. En el futuro, esto debería permitir una mejor selección de secuencias de ARN que solo reconozcan la secuencia objetivo deseada, mejorando así la precisión de las manipulaciones genéticas.

Debido a que los nanomotores diseñados son universales en su idoneidad para medir torsiones y pares en moléculas individuales, también se pueden usar para otros complejos CRISPR-Cas o biomoléculas.

El trabajo fue financiado por el Consejo Europeo de Investigación y la Fundación Alemana de Investigación y se llevó a cabo en colaboración con el grupo de investigación del profesor Virginius Cseknes de la Universidad de Vilnius en Lituania, que aisló y puso a disposición los complejos CRISPR utilizados.