Los principales sistemas de edición de genes de próxima generación amplían las aplicaciones clínicas y de investigación de la tecnología

Crédito: Susanna Hamilton, Broad Communications

Los investigadores aumentaron la eficiencia de la edición primaria, una tecnología de edición de genes versátil basada en CRISPR, y utilizaron el sistema mejorado para corregir mutaciones patológicas en las células.

Los científicos han desarrollado un conjunto de herramientas moleculares que aumentan la eficiencia de una tecnología de edición de genes llamada edición primaria para una variedad de tipos de células y genes diana, ampliando las aplicaciones terapéuticas y de investigación de la tecnología. En dos nuevos estudios, los investigadores utilizaron sistemas de edición primaria mejorados para corregir mutaciones asociadas con varias enfermedades neurodegenerativas, metabólicas y cardiovasculares.

Fue descrito por primera vez en 2019La edición primaria es un método preciso de edición de genes que tiene el potencial de corregir la gran mayoría de las variaciones genéticas conocidas que causan enfermedades. Los investigadores pueden utilizar la edición inicial para trabajar ADN Sustituciones, inserciones y deleciones en sitios diana en células humanas y animales. Sin embargo, la eficacia de la edición varía según el tipo de célula que se está editando y el sitio de destino en el genoma.

Para desarrollar aún más la tecnología, los científicos del Broad Institute con Y Harvard es una mejora en un componente clave del sistema de edición básico llamado ARN guiado por edición o «pegRNA», que codifica la modificación deseada y dirige la maquinaria de edición inicial. En un estudio publicado recientemente en biotecnología de la naturaleza, los investigadores demostraron que los pegRNA se pueden degradar en las células, cortando los pegRNA que interfieren con la edición inicial. Han desarrollado nuevos pegRNA que están protegidos de la degradación en las células, lo que ha aumentado la eficiencia de la edición a gran escala.

En un segundo estudio publicado recientemente en celdaInvestigadores extensos, colaborando con científicos en Universidad de Princeton y la Universidad de California, San Francisco (UCSF), identificaron las vías celulares que limitan la eficiencia de la edición primaria y utilizaron estos conocimientos para desarrollar la próxima generación de sistemas de edición primaria.

En ambos estudios, los investigadores demostraron que los nuevos sistemas podrían modificar de manera más eficiente las mutaciones asociadas. Enfermedad de Alzheimer Enfermedad cardíaca, anemia de células falciformes, enfermedad priónica, diabetes tipo 2 y otras enfermedades, con menos subproductos no deseados producidos.

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David Liu, autor principal de ambos estudios, dijo el profesor Richard Merkin y director del Instituto Merkin de Tecnologías Transformativas en el Cuidado de la Salud en el Instituto Broad, profesor de la Universidad de Harvard e investigador del Instituto Médico Howard Hughes.

Editor en jefe de infografía del genoma

Crédito: Instituto Broad

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La edición inicial permite a los científicos corregir la gran mayoría de las mutaciones conocidas que causan enfermedades, incluidas sustituciones, inserciones o eliminaciones de hasta docenas de pares de bases, en ubicaciones específicas del genoma. A diferencia de otras técnicas de edición del genoma, la edición primaria no implica cortar ambas cadenas de ADN y, como resultado, reduce las posibilidades de resultados de edición no deseados o respuestas celulares no deseadas. (Consulte el cuadro anterior para obtener más información sobre cómo funciona la edición principal). Cientos de grupos de investigación están utilizando la edición principal para estudiar y corregir mutaciones en una amplia variedad de organismos, incluidos el arroz, el trigo, el pez cebra y los ratones.

Después de describir la edición inicial por primera vez en 2019, el equipo de Liu continuó desarrollando la tecnología. En el biotecnología de la naturaleza En el estudio, descubrieron una vulnerabilidad en los pegRNA que reduce la eficiencia. Descubrieron que la larga cadena de ARN Al final, el pegRNA que codifica la modificación fue sometido a degradación por enzimas celulares. Los pegRNA degradados no pueden mediar en la edición inicial y también «envenenar» el sistema de edición principal al bloquear el acceso a los sitios objetivo por pegRNA intactos.

A continuación, los investigadores buscaron las estructuras protectoras que podrían agregar a los pegRNA. Probaron varias secuencias de ARN diferentes, identificando las que se pliegan en estructuras en forma de nudo que las protegen de las enzimas que degradan el ARN. Cuando modificaron los pegRNA para incluir nodos y secuencias de contacto, observaron un aumento significativo en la eficiencia de edición inicial, lo que indica que las nuevas estructuras conservaban la plantilla de RNA para la edición.

Usando pegRNAs, o epegRNAs, en un grupo de líneas celulares de mamíferos, los investigadores vieron que los epegRNAs aumentaron la eficiencia de edición inicial de tres a cuatro veces en promedio, con mayores mejoras en las líneas celulares en las que la edición inicial era anteriormente más difícil.

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Orientación de la celda hacia las ediciones iniciales

En el celda En el estudio, el equipo y los colaboradores de Liu diseñaron el componente proteico del sistema de edición principal para aumentar la eficiencia y reducir los subproductos producidos en una amplia gama de tipos de células, incluidas las células de los pacientes.

Los investigadores tienen como objetivo comprender de manera más completa los factores celulares que determinan los resultados de la edición inicial para que puedan diseñar sistemas más eficientes. El equipo sospechaba que algunas proteínas celulares que están activas durante una parte clave del proceso de edición primaria, cuando la célula repara las moléculas de ADN creadas por los editores maestros, podrían obstaculizar o incluso revertir la modificación y aumentar la producción de subproductos no deseados. Para probar esta hipótesis, los investigadores colaboraron con equipos dirigidos por Brett Adamson, profesor asistente de la Universidad de Princeton. y Jonathan Wiseman, profesor de UCSF cuando comenzó el estudio, y ahora profesor del MIT y miembro del Instituto Whitehead e investigador del Instituto Médico Howard Hughes. Utilizando pantallas CRISPR basadas en interferencias, los equipos examinaron sistemáticamente el efecto de desactivar cada uno de los 476 genes de reparación de ADN diferentes en la edición inicial.

Con base en estos hallazgos, los investigadores se enfocaron en un proceso llamado reparación de desajustes, que ocurre naturalmente en las células para corregir los desajustes de ADN producidos durante la replicación y reparación del ADN. Encuentran que la reparación de discrepancias interfiere con la edición inicial, reduce la eficiencia de la edición y aumenta la parte de inserciones o eliminaciones no deseadas.

Armado con esta información, el equipo desarrolló nuevos sistemas de edición primaria, a los que llamaron PE4 y PE5, que incluyen una proteína, MLH1dn, que los investigadores diseñaron para bloquear temporalmente un componente de reparación de desajustes. En las celdas donde se produce la reparación de desajustes, los investigadores encontraron que PE4 y PE5 aumentaron significativamente la eficiencia de edición y produjeron significativamente menos subproductos en comparación con los sistemas de edición primarios actuales.

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Finalmente, los científicos han creado PEmax, que ha mejorado la arquitectura y el amino agrio Secuencia de máquinas de edición primarias. La combinación de mejoras de los sistemas PE4, PE5, PEmax y epegRNAs resultó en un aumento de 10 a 100 veces en la eficiencia de edición en comparación con los sistemas actuales.

«Al reunir la experiencia de diferentes grupos de investigación, pudimos aprender cómo funcionaba la edición inicial y mejorar partes del sistema», dijo Adamson. «Este estudio es un hermoso ejemplo de cómo la comprensión básica puede impulsar el diseño experimental».

hacia la curación

En muchos casos, dice Liu, las mejoras combinadas de epegRNA y PE4 / 5 / max facilitan a los científicos la creación de modelos celulares de la enfermedad, un paso fundamental hacia el desarrollo de tratamientos.

El equipo ahora está utilizando estos sistemas para tratar modelos celulares y animales de enfermedades genéticas y continuará explorando la biología básica de estos sistemas.

«Todas estas innovaciones son sinérgicas», dijo Liu. «Gracias a estas mejoras, hemos podido modificar de manera eficiente y limpia tipos de células importantes que algún día podrían ayudar a los pacientes con enfermedades con un componente genético. Estos resultados también sugieren que existen otras estrategias que pueden mejorar aún más la edición inicial».

Referencias:

«Sistemas de edición primarios mejorados mediante la manipulación de determinantes celulares para modificar los resultados» por Peter J. Chen, Jeffrey A. Hausmann, John Yan, Frederic Nipping, Purnima Ravizankar, Ben Fang Chen, Sidi Chen, James W. Nelson, Gregory A. , Mostafa Şahin, Mark J. Osborne, Jonathan S. Weissman, Brett Adamson y David R. Leo, 14 de octubre de 2021, celda.
DOI: 10.1016 / j.cell.2021.09.018

“Los pegRNA diseñados mejoran la eficiencia de edición inicial” por James W. Nelson, Peyton B. Randolph, Simon B. Sheen, Kelsey A. Everett, Peter J. Chen, Andrew F. Chen, Alvin Hsu y David R. Liu, 4 de octubre de 2021, disponible aquí. biotecnología de la naturaleza.
DOI: 10.1038 / s41587-021-01039-7

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Merkin de Tecnologías Transformadoras en el Cuidado de la Salud, los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Médico Howard Hughes, la Fundación Loulou y la Fundación Bill & Melinda Gates.

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